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生物因子促進牽張成骨區骨生成與礦化的研究進展

更新時間:2019-08-26   骨科51


牽張成骨理論是Ilizarov于20世紀60年代提出的,是一個新生骨形成的過程,稱為“骨再生”。Il-izarov對牽張成骨的條件做了嚴格的限定,即微創截骨、牢固固定、緩慢而有節律地延長,才能保證有效的成骨,延長速度過快會致骨不連,由于延長節律緩慢,治療周期較長,往往會產生一系列的并發癥如釘道感染松動、關節攣縮、延遲整合以及再骨折。如何促進牽張成骨區骨形成及礦化,縮短治療周期是矯形外科界目前的研究熱點。隨著矯形外科學的發展,對促進牽張成骨區骨形成及礦化的研究顯得尤為重要,尤其是生物因子的促進作用。現將國內外相關文獻進行綜述。


BMPs類


骨形成蛋白(BMPs)是間充質細胞向骨細胞系轉化的最初信號分子,它啟動間充質細胞向骨細胞分化,與誘導骨生成關系最為密切。為了促進延長區新骨的生成,許多學者進行了研究,在延長區直接注射生長因子促進成骨,諸如BMP,PDGF,IGF,FGF及VEGF等,這些因子中BMP最常用。為研究rhBMP-2促進長骨截骨端愈合的作用,Song等對截骨延長術后小鼠進行分組實驗,通過影像和組織染色對比,實驗組骨小梁厚度明顯比對照組增加,在成骨區局部注入rhBMP-2可加速骨愈合。為解決牽張開始時成骨區經皮靶向注射的問題,Konas等設計了可在牽張期持續局部給藥到成骨部位的內部牽張器,觀察研究連續注入含殼聚糖水凝膠的BMP-2是否會提高放射學和組織學參數,實驗證實連續給藥可有效地穩定成骨區,促進成骨并增加骨礦化。Nunotani等對4組兔肢體延長模型進行不同條件下干預,通過放射學、組織學以及生物力學測試證實在牽張成骨早期BMP-2可加快骨再生。


Park等將BMP-2直接固定于GER(引導骨再生)膜上,GER膜由納米纖維狀殼聚糖膜組成并可提供提高骨再生能力的生物力學表面。BMP-2結合GER膜表面有長達4周的生物活性,并保持BMP-2的初始結合量超過50%。此外BMP-2結合殼聚糖膜顯著促進細胞增殖、堿性磷酸酶活性以及鈣沉積。Park認為BMP-2結合在殼聚糖膜上適用于在骨再生后期中顯著誘導和定位骨形成。Niedhart等在小鼠股骨干缺損處放置骨水泥結合不同劑量的rhBMP-2、自體骨和曠置等不同方法處理。通過放射學、組織學、組織形態學和彎曲測試檢查證實,rhBMP-2最大劑量組骨痂形成量最多,且呈劑量依賴性。所以,TCP/rh-BMP-2復合材料可代替自體骨移植用于臨床。為測試rhBMP-7在牽張成骨期間促進骨生成的效果,Mi-zumoto等將14只股骨截骨術后的小白鼠用外固定器固定并隨機分組,實驗組應用rhBMP-7水溶劑,于術后將藥物注入截骨間隙,牽張結束后通過影像學和骨礦化密度測量得出:注入rhBMP-7可促進骨再生速度,增加骨密度與新生骨的生物力學性能。


PRP類


1993年Hood等首先提出富血小板血漿(PRP)概念,并發現PRP含有豐富的血小板,其數目比全血中數目高3倍以上。PRP能夠在牽張成骨過程中促進新骨生成:(1)源于其分泌的多種高濃度生長因子的聯合作用;(2)PRP在凝血酶和鈣離子的作用下被激活為自體纖維蛋白凝膠,為牽張成骨提供有利于成骨細胞增殖與分化的微環境,從而促進牽張成骨。PRP中高濃度的血小板可作為傳送超生理濃度的生長因子到受傷部位的載體,并可加速骨再生。Yamada等利用組織工程學技術,在骨缺損部位進行骨再生,進而代替骨移植,通過在犬骨延長模型上應用PRP作為自體支架在體內擴增MSCs來增加骨生成,對新生骨進行放射學、組織學和組織形態學分析,MSCs(dMSCs)/PRP組有良好的骨生成和新血管形成,新成骨體積最大。結果表明,dMSCs/PRP混合物可替代骨移植治療骨缺損。


PRP結合MSCs在臨床應用方面的研究也有一定進展,Kitoh等通過在成骨期移植MSCs和PRP對其促進成骨的作用進行臨床研究,首先在患者延長期和固化期將培養擴增的成骨細胞、自體PRP、凝血酶與鈣劑的混合物注入成骨區骨痂,2例軟骨發育不全和1例先天性脛骨假關節患者的患肢得到延長,平均愈合指數為23.0d/cm,MSCs和PRP可通過在成骨期加速骨再生來縮短治療周期。之后Kitoh等回顧性研究在牽張成骨區有與無BMC(骨髓細胞)和PRP治療骨缺損的差別來評價其效果,對46例患者長骨進行延長,移植培養擴增的BMC和PRP到成骨區,根據有無(BMC+PRP)治療分為兩組。BMC-PRP(+)組在身材矮小和肢體長度差異方面顯著低于BMC-PRP(-)組(分別為P=0.0019,P=0.0031)。


在BMC-PRP(-)組觀察到固化期延遲率為45%,而BMC-PRP(+)組未觀察到,所以BMC和PRP通過加速新骨形成與固化縮短治療期、減少相關并發癥的發生。在總結前人的理論和實驗結果的基礎之上,Malhotra等闡述PRP可否促進骨愈合并提出了骨愈合機制的核心理解和PRP中存在的生物因子。PRP盡管有穩定的科學基礎,它結合骨誘導支架在促進骨折愈合方面使用是有利的,然而,同種異體和自體移植物不是合適載體。積極的處理技術和超高濃度的PRP并不一定會改善治療結果,不一致的實驗結果限制了它在促進骨愈合方面的廣泛應用。當前PRP制劑的發展水平,可能成為影響其有效性和骨缺損愈合相關治療結果的關鍵方面。此外,許多其他變量制約PRP的制備和使用,影響其療效。可見,PRP的動物研究與臨床應用還有很廣闊的研究空間。


生長激素


促進延長區骨礦化最常用的生物因子是BMPs和PRPs,且研究的也較成熟,然而其他類生物因子也在研究中。為了確定GH,IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ和BMP-2在固化期誘導骨再生的能力并比較牽張成骨和截骨誘導骨形成的區別,Theyse等在犬下頜骨上截骨延長并對這些因素的表達水平進行測定,測量血漿中GH、IGF-I,IGF-Ⅱ的濃度分布及IGFBP-4和6(胰島素樣生長因子結合蛋白4和6)的含量以評估其在骨形成過程中的作用,IGF-Ⅰ與BMP-2的表達顯著增加(這些因子在成熟骨中表達)。表明生長激素可以加速延長區骨再生,這可在臨床上用來縮短骨延長的治療周期。


凝血酶相關肽TP508


TP508在牽張成骨期間可促進骨再生,縮短治療周期,減少相關并發癥的發生,Li等在兔下肢延長模型上測試了TP508加速牽引成骨固化期的能力。TP508(0、30、300μg加于300μl生理鹽水中)分別于延長開始和結束時注入牽張間隙,在延長2周后處死動物。實驗結束時,TP508治療組中多數動物牽張間隙骨固化完整,骨再生部位CT掃描檢查示BMD(骨礦物質密度)比對照組大,骨固化和骨重建在TP508(300μg)治療組多見,且再生部分主要是充分血管化的編織骨。該研究表明,在牽張成骨中局部應用TP508可促進骨形成和固化。通過應用Runx2蛋白免疫定位檢測TP508在牽張成骨期間對骨再生的影響,Amir等對兔脛骨截骨延長6d,并于延長開始和結束將TP508注入牽張間隙,2周后收集組織樣本并進行免疫組化處理分析,并通過聚合酶鏈反應分析測試TP508對成骨樣細胞Runx2mRNA體外表達的影響。結果在300mgTP508治療組顯示有較多的Runx2表達的細胞。


可見,TP508通過增加成骨細胞譜系的細胞比例來增強骨再生,臨床上,TP508可用于縮短愈合時間,在牽張成骨延長區注入TP508可明顯縮短骨固化期。Wang等深入研究在成骨區注射TP508+緩釋劑的作用,延長期結束時在兔牽張成骨模型上注射少量TP508(300mg),通過分組實驗及實驗室檢查證實,TP508+PPF/PLGA組骨形成及固化最早,BMD明顯高于對照組,TP508可顯著增強骨固化過程,但仍需進一步檢查以確定PPF/PLGA微粒可否成為增加骨形成理想的給藥形式。為檢測不同劑量TP508局部注射能否促進大鼠脛骨牽張成骨部位骨固化,Cakarer等將48只大鼠隨機分為兩實驗組(注射10μg或100μgTP508)與一對照組(注射生理鹽水),處死動物后組織形態學分析表明TP508可使較多新骨形成(P<0.003,P<0.0001)。研究結果表明,在牽張期結束時單次注射TP508增加固化期骨硬度,大劑量使用時有效時間點將推遲。


胰島素樣因子(IGF)和轉化生長因子(TGF)


生物活性分子IGF-Ⅰ(胰島素樣因子1)和TGF-β1(轉化生長因子β1)合并骨誘導替代材料的使用可縮短成骨治療周期。為探究全身和局部注射重組人IGF-Ⅰ(rhIGF-Ⅰ)對老年小鼠模型新生骨形成的影響,Fowlkes等采用牽張成骨小鼠模型,持續注入rhIGF-Ⅰ,輸送至成骨部位或全身吸收,觀察其對小鼠骨形成的影響。結果在牽張間隙顯示rhIGF-Ⅰ治療小鼠的新骨形成明顯增加。局部和全身應用rhIGF-I可增加小鼠模型新骨的形成,表明IGF-Ⅰ可用于改善老年性骨質疏松癥,由于IGF-I全身用藥可能產生副作用,包括增加患癌癥的風險,研究發現局部應用IGF-I可提高骨再生而不增加循環血中IGF-I的濃度,這種方法可用于老年高危人群,但缺乏相應的臨床實驗研究。


控釋IGF-Ⅰ和植入來自涂層降解的TGF-β1可刺激骨折愈合,為了探討局部應用IGF-Ⅰ/TGF-β1聚交酯膜對骨痂延遲形成的影響,Bernstein等通過單邊固定器對28只羊持續牽張30d,在固化開始時,局部應用生長因子IGF-1/TGF-β1聚交酯膜,松質骨填充缺陷或兩者同時應用,2個月后,解剖雙側脛骨并進行組織學和組織形態學分析,發現兩治療組骨形成量高于松質骨填充骨缺損組,成骨的差異未達到統計學水平。三組相比,最好是實現兩者結合。Kroczek等實驗結果也認為TGF-β和IGF-Ⅰ對骨再生有促進作用,但不如BMP作用強。


干細胞應用


骨髓間充質干細胞(BMMSCs)和脂肪組織來源干細胞(ADSCs)被廣泛用作細胞療法的來源或基因轉移載體。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)有很高的促進骨再生潛力,但其在體內半衰周期短,為對牽張成骨區骨痂形成進行深入研究,Hu等應用隨機分組實驗觀察BMP-7間接體內基因療法對小鼠牽張成骨區骨痂形成的影響,通過影像學、組織學、免疫組化和掃描電鏡檢查以及Ca/P比值分析表明:基于MSCs轉染BMP-7體內基因轉移可在牽張成骨區增加骨痂形成和促進固化。局部基因療法可促進牽張成骨,尤其適用于骨質疏松、嚴重創傷、腫瘤術后放療等累及成骨潛力的患者。為觀察BMMSCs在有無bFGF基因轉染的情況下對骨再生的影響,Jiang等通過兔牽張成骨模型對42只新西蘭兔下頜骨進行快速延長,在牽張結束時,將生理鹽水、自體BMMSCs和經bFGF轉染的BMMSCs分別注入三組實驗動物的成骨間隙,8周后取出下頜骨并進行影像學與組織學測試。兩實驗組均觀察到良好的骨形成,骨痂組織中有較高骨密度(BMD)和骨礦物質含量(BMC),微細結構更成熟;經bFGF轉染BMMSCs組顯示良好的骨形成與最高BMD和BMC,三點彎曲測試測得BT/TV值最高。


結果表明,BMMSCs移植能促進骨形成,使bFGF更有效。為研究人MSCs異種移植的方法在宿主動物骨再生過程中的誘導作用,Kim等通過不同時間在兔牽張成骨模型上注射hMSCs調查其促進骨再生效果。在牽張開始和結束時將未分化的hMSCs經皮分別注入下頜骨截骨端。顯微CT評價顯示:實驗組牽張的骨痂體積明顯增加,BMD增加,牽張開始前注入hMSCs骨礦化密度更高并表達IGF-1和FN(纖連蛋白)。這些結果顯示在牽張成骨開始時將hMSCs移植入兔牽張模型促進骨生成效果更好。


自從2001年Zuk等從脂肪中提取出了具有多向分化潛能的干細胞后,脂肪組織來源干細胞(ADSCs)以其來源廣泛,取材方便,擴增迅速等優點迅速成為了組織工程和再生醫學的研究熱點。大量研究證實,ADSCs具有多向分化的潛能,在體外可以向骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經及內皮等多種細胞分化。有動物實驗發現,ADSCs在活體內能刺激自體的BMP-2和VEGF等生長因子的分泌表達,從而促進成骨和血管形成。因此,ADSCs可作為構建骨組織工程中的種子細胞,也可以作為基因治療中接受目標基因的載體細胞,具有不可多得的優勢和應用前景。


綜上所述,隨著美容與矯形醫學技術的發展,生物因子促進成骨區骨生成與礦化在臨床上的應用逐漸顯現。近幾年來國內外學者對一系列的生物因子做了一定的研究,但仍有很多問題存在:有關BMP類生物因子的實驗研究所用實驗動物較少,缺乏大樣本資料比較系統的描述及其臨床應用的相關報道;PRP類生物因子的量化應用以及其與其他因子聯合應用時的實驗效果缺乏一致的結論,PRP制備與分離缺乏統一的原則給學者量化研究PRP帶來了諸多不便;其他諸多生物因子用于促進成骨區骨生成及礦化在理論上具有一定的可行性,而臨床實踐較少,故這些生物因子的臨床應用還有待進一步研究;生物因子與理化刺激以及與中醫中藥聯合應用促進成骨區骨生成及礦化的研究,國內外報道較少。因此對生物因子促進牽張成骨區骨礦化的后期研究仍有十分廣闊的應用前景。


來源:中國矯形外科雜志2015年4月第23卷第8期

作者:上海交通大學附屬第六人民醫院骨科 陳紅浩




(文章發布于:2015-05-04)

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